SKKN Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ r2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc

Nội dung tóm tắt: SKKN Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ r2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc

1. 7.4.4. Phân lập và tách dòng gen OsDREB1F liên quan đến khả năng chịu lạnh ở lúa Qua nghiên cứu về đặc điểm nông học ở thế hệ R2, đặc điểm hoá sinh và khả năng chịu lạnh của các dòng chọn lọc so với giống gốc ở thể hệ R3 chúng tôi đã chọn ra ở giống lúa Xuân Châu Hương hai dòng là R3.13 và R3.44 có những đặc điểm nổi bật hơn cả (thời gian sinh trưởng ngắn, chiều dài bông tăng, số nhánh hữu hiệu/khóm, số hạt chắc trên bông, khối lượng 1000 hạt và năng suất cao hơn so với đối chứng và các dòng khác), để tiến hành phân lập và tách dòng gen liên quan đến khả năng chịu lạnh của cây. 7.4.4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của dòng chọn lọc R3.13 và R3.44 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở cấp độ phân tử. Chất lượng của DNA tổng số có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của các thí nghiệm. Tôi đã tiến hành tách chiết DNA tổng số của hai dòng lúa nước là R3.13 và R3.44 có nguồn gốc từ giống XCH theo phương pháp của Foolad và cs (1995) [41] Sau khi tách DNA tổng số, tôi tiến hành kiểm tra chất lượng và nồng độ DNA tổng số bằng cách điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm bản gel trong ethydium bromide và soi dưới ánh đèn cực tím cho thấy mẫu DNA thu được có chất lượng tốt, DNA tập trung một băng chính và không bị đứt gãy (hình 3.4). Đo OD 260nm và 280nm, chúng tôi đã xác định được hàm lượng DNA trong dung dịch của R3.13 là 115,3µg/ml và R3.44 là 145,62µg/ml. Như vậy chất lượng và hàm lượng của 2 dòng lúa này đủ điều kiện để thực hiện các phản ứng tiếp theo. Hình 3.4. Kết quả tách chiết DNA tổng số của 2 mẫu lúa M: marker; 1: R3.13; 2: R3.44 36
2. 7.4.4.2. Nhân gen OsDREB1F bằng kỹ thuật PCR Sử dụng DNA hệ gen làm khuôn để nhân gen OsDREB1F với cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự DNA phân lập từ lúa được công bố bởi Qiuyun Wang và cs (2008), có mã số trên GenBank là AY785897 [48]. Gen OsDREB1Fcó chiều dài 660 bp mã hóa cho phân tử protein gồm 219 axit amin với khối lượng phân tử là 23,8 kDa.Trên cơ sở xác định được nồng độ DNA khuôn tối ưu cho phản ứng PCR, tôi đã tiến hành nhân gen OsDREB1F của 2 dòng lúa có khả năng chịu lạnh tốt nhất là R3.13 và R3.44 có nguồn gốc từ XCH. Phản ứng PCR để nhân gen được thực hiện trên máy PCR với cặp mồi đặc hiệu là DREB1F và DREB1R. Nhiệt độ gắn mồi là 54oC, kích thước đoạn gen cần nhân ước tính khoảng 570bp. Kết quả nhân gen được thể hiện trên hình 3.5 M 1 2 570 bp Hình 3.5. Kết quả nhân gen osDREB1F của 2 mẫu lúa M: marker; 1: R3.13; 2: R3.44 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen DREB1F trên hình 3.5 cho thấy, ở mẫu nghiên cứu xuất hiện phân đoạn DNA đặc hiệu có kích thước gần đúng theo tính toán lý thuyết là khoảng 570bp, hàm lượng của sản phẩm đủ lớn để sử dụng cho việc tách dòng gen.Tiến hành tinh sạch các phân đoạn DNA này theo bộ Kit của hãng Bioneer ( AccuPrep PCRPurification Kit) để thu nhận đoạn gen mong muốn trước khi biến nạp để chuẩn bị cho bước tách dòng gen. 37
3. 7.4.4.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và chọn dòng plasmit tái tổ hợp mang gen osDREB1F Gen quan tâm sau khi được nhân lên nhờ phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu và được tinh sạch sẽ được nối vào vector tách dòng pBT. Trình tự của gen quan tâm sẽ được nối vào vị trí MCS (multiple conoling site) ở trên trình tự của gen GUS có trên pBT. Sau đó vector pBT sẽ được biến nạp vào tế bào Ecoli DH5α và được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh ampicillin, cơ chất X-gal, chất cảm ứng IPTG. Sau đó các tế bào này sẽ được nuôi ở 370C trong 16 giờ. Hình 3.6. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Khi có các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng mọc được trên môi trường chọn lọc chứng tỏ chúng đều mang vector pBT. Trong đó Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vector pBT lac-operon hoạt động bình thường, không có đoạn gen lạ nào xen vào, khi có chất cảm ứng của IPTG sẽ tổng hợp enzim  - galactosidase, enzym này sẽ chuyển hoá cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng có thể là do nhận được plasmit mang lac operon không hoạt động. Chính vì vậy, khi có chất cảm ứng IPTG thì gen 38
4. không tổng hợp enzym  -galactosidase và không xảy ra sự chuyển hoá X-gal. Lac operon bị bất hoạt là do đoạn DNA ngoại lai xen vào giữa promoter của operon gen lacZ. Chính vì vậy lac operon không thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã, nên không có sự dịch mã thành enzym được. Để kiểm tra xem các dòng khuẩn lạc trắng này có mang gen quan tâm không, chúng tôi tiến hành phản ứng conoly PCR với cặp mồi pUC18. Kết quả được thể hiện trên hình 3.7. 5 4 3 2 1 M 750 bp 500 bp Hình 3.7. Kết quả conoly PCR từ các dòng khuẩn lạc trắng (M: marker; 1-2: dòng khuẩn lạc của mẫu R3.13; 3-5: dòng khuẩn lạc của mẫu R3.44) Vì pUC là mồi thiết kế chung cho các vector tách dòng nên khi kiểm tra sản phẩm colony-PCR vừa dòng hoá thì kích thước của sản phẩm sẽ cao hơn đoạn gen mã hóa osDREB1F. Kết quả kiểm tra cho thấy kích thước của gen quan tâm sẽ ở vị trí tăng 180 bp so với khi PCR với mồi pUC18. Kết quả trên hình 3.7 cho thấy ở giếng từ 1 đến 3 đều xuất hiện các vạch ở vị trí khoảng 750 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết về kích thước của gen quan tâm khi PCR với mồi pUC18. Có thể kết luận ban đầu rằng các dòng khuẩn lạc tương ứng đều mang gen quan tâm. Các dòng mang plasmid có gen osDREB1F được nhân lên để tách plasmid. 39
5. 7.4.4.4.Tách DNA plasmid tái tổ hợp Nuôi khuẩn lạc trắng đã chọn bằng colony-PCR mang gen osDREB1F trong 3ml môi trường LB lỏng rồi tách phục vụ cho việc xác định trình tự. Tế bào được thu bằng cách ly tâm, rồi hoà tan trong TELT, lysozym được bổ sung nhằm phá vỡ màng tế bào vi khuẩn. Bổ sung izopropanol làm kết tủa DNA, protein. Làm sạch DNA bằng cồn 80%. Sau đó ủ với Ribonuclease trong 2 giờ để loại hết RNA. Cuối cùng, plasmit tiếp tục được tinh sạch để đọc trình tự nucleotit. Plasmit tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agrarose 0,8%. M 1 2 4500 bp 2500 bp Hình 3.8. Kết quả tách chiết plasmid của các dòng khuẩn mang vector tái tổ hợp M: marker; 1, 2: plasmid mang gen tương ứng của các mẫu R2.13, R2.44 Kết quả tách chiết plasmid trên hình 3.8 cho thấy, các mẫu DNA plasmit tinh sạch đạt kết quả tốt, đều có các băng vạch rõ nét và gọn chứng tỏ plasmid không bị đứt gẫy và có hàm lượng lớn đủ điều kiện cho bước giải trình tự. Để khẳng định lại các plasmit cần tìm có gắn đoạn gen sản phẩm PCR hay không, chúng tôi đã chọn DNA plasmit đã tinh sạch của mẫu thí nghiệm để tiến hành cắt bằng enzym giới hạn BamHI ở 37oC trong 2 giờ. Vị trí của enzym này trong vector là nằm ở hai đầu đoạn gắn. Vì trong trình tự của gen osDREB1F ở dữ liệu trên NCBI có một điểm cắt của enzym giới hạn ở vị trí khoảng 430 bp. Kết quả cắt được thể hiện trên hình 3.9. 40
6. M 1 2 2500 bp 430 bp Hình 3.9. Kết quả cắt plasmid của các dòng khuẩn mang vector tái tổ hợp M: marker; 1, 2: plasmid mang gen tương ứng của các mẫu R2.13, R2.44 Trên hình 3.10 cho thấy cả 2 giếng đều có 2 băng trong đó băng trên có kích thước khoảng 2500 bp là plasmid pBT và băng dưới là gen osDREB ở vị trí đúng như tính toán lý thuyết là xấp xỉ 430 bp. Như vậy có thể lấy plasmid đem đi đọc trình tự. 8. NHỮNG THÔNG TIN CẦN BẢO MẬT (NẾU CÓ). 9. CÁC ĐIỀU KIỆN CẦN THIẾT ĐỂ THỰC HIỆN. Sáng kiến kinh nghiệm: “Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc” được áp dụng tại xã Đại Đồng, huyện Vĩnh Tường, tỉnh Vĩnh phúc trong thời gian một năm, để sáng kiến có hiệu quả cao hơn thì cần có thêm những điều kiện sau: - Việc đánh giá các dòng lúa phải được thực hiện trên phạm vi diện tích lớn để đảm bảo tính chính xác, khoa học. - Để đánh giá khả năng chịu lạnh các dòng lúa cần tiến hành trong thời gian một số vụ khác nhau. - Cần có sự tạo điều kiện về thời gian, hỗ trợ vật chất như giống, phân bón của các cơ quan, đơn vị trên địa bàn tỉnh như : sở nông nghiệp và phát triển nông thôn, sở giáo dục và đào tạo, trường THPT Nguyễn Thị Giang 41
7. 10. ĐÁNH GIÁ LỢI ÍCH CỦA VIỆC ÁP DỤNG SÁNG KIẾN. Sau thời gian nghiên cứu đề tài “Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc” đề tài đã thu được một số hiệu quả sau: 1. Các dòng chọn lọc ở thế hệ R2 có nhiều đặc điểm nổi bật hơn so với giống gốc (chiều cao cây cao, chiều dài bông, số nhánh hữu hiệu/khóm, khối lượng 1000 hạt ). Mức độ biến động của nhiều tính trạng nông học có sự ổn định trong thế hệ R2 cho phép rút ngắn thời gian chọn lọc. 2. Ở giai đoạn cây mạ 3 lá có 74,2% các dòng chọn lọc có sự gia tăng khả năng chịu lạnh so với giống gốc, đặc biệt là các dòng R3.13, R3.04 và R3.44. Sau khi xử lý lạnh có 12/14 dòng chọn lọc có hàm lượng diệp lục cao hơn giống gốc. Sự giảm sút của hàm lượng diệp lục có mối tương quan nghịch với khả năng chịu lạnh của các dòng nghiên cứu. 3. Thu được 100% các dòng chọn lọc thế hệ R3 có nguồn gốc từ giống XCH có chất lượng hạt tốt hơn so với giống gốc trong đó R3.44 là tốt nhất. 4. Đã khuếch đại, tách dòng thành công osDREB1F của hai dòng chọn lọc có nguồn gốc từ giống lúa XCH là R3.13 và R3.44. 5. Từ các dòng chọn lọc qua 2 thế hệ đã chọn được 2 dòng nổi bật là R3.13 và R3.44 có nguồn gốc từ giống lúa XCH có đặc điểm năng suất cao và khả năng chịu lạnh cao hơn so với giống gốc. 6. Đề nghị: Dòng R3.13 và R3.44 có nguồn gốc từ giống XCH có khả năng chịu lạnh tốt nhất trong số các dòng lúa nghiên cứu, có thể tuyển chọn cho các vùng trồng lúa thường xuyên xảy ra lạnh giá. Cần tiếp tục nghiên cứu để tìm quy luật biến đổi trình tự gen osDREB1F và trình tự amin acid của DREB1F liên quan đến tính chịu lạnh của cây lúa . 42
8. 11. DANH SÁCH NHỮNG TỔ CHỨC, CÁ NHÂN THAM GIA ÁP DỤNG THỬ HOẶC ÁP DỤNG SÁNG KIẾN LẦN ĐẦU: STT Tên tổ chức/ cá Địa chỉ Phạm vi, lĩnh vực nhân áp dụng sáng kiến 1 Phùng Thị Quảng Xã Đại Đồng- huyện Vĩnh Tường- Thử áp dụng lần Vĩnh Phúc. đầu 2 Nguyễn Thị Sen Xã Đại Đồng- huyện Vĩnh Tường- Thử áp dụng lần đầu Vĩnh Phúc. 3 Nguyễn Thị Tư Xã Đại Đồng- huyện Vĩnh Tường- Thử áp dụng lần đầu Vĩnh Phúc. 4 Nguyễn Thị Liễu Xã Đại Đồng- huyện Vĩnh Tường- Thử áp dụng lần đầu Vĩnh Phúc Tôi xin chân thành cảm ơn! Vĩnh Tường, ngày 12 tháng 2 năm 2019 Vĩnh Tường, ngày 12 tháng 2 năm 2019 P.Hiệu trưởng phụ trách CM Tác giả sáng kiến Lê Hoàng Hiệp Dương Thị Thu Huyền 43
9. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Lê Trần Bình, Võ Thị Ngọc Diệp, Lê Thị Muội (1995), “Nghiên cứu khả năng chịu lạnh và chịu khô ở mức độ mô sẹo lúa của các giống có nguồn gốc sinh thái khác nhau”, Tạp chí Sinh học, 17 (1), tr. 25 – 29. 2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội. 3. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với thiệt hại do môi trường của cây lúa, NXB Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. 4. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo dục, tr. 54 - 55. 5. Lê Xuân Đắc (2007), Nghiên cứu biện pháp công nghệ sinh học thực vật nhằm cải biến tính trạng chiều cao cây lúa, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội. 6. Lê Xuân Đắc (1998), “Sự dụng công nghệ tế bào thực vật vào việc cải tiến một số đặc điểm nông học của giống lúa C71 và nếp TK90”. Luận văn thạc sĩ Sinh học, viện Công Nghệ Sinh Học Việt Nam. 7. Nguyễn Ngọc Đệ (2008), Giáo trình cây lúa, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. 8. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2007), ‘‘Cấu trúc vector plasmid mang gen kháng sâu và ứng dụng trong tạo cây trồng chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens’’, Hội nghị Khoa học và Công nghệ 2007, tr. 345 - 350. 9. Phạm Thị Hạnh, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2007), ‘‘Tạo cây thuốc lá kháng thuốc trừ cỏ và côn trùng ’’, Hội nghị Khoa học và Công nghệ 2007, tr. 351 - 357. 10. Nguyễn Thị Thu Hoài (2005), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và mối quan hệ di truyền ở một số giống lúa cạn địa phương, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên. 44
10. 11. Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên. 12. INGER, IRRI (1996), Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa, Xuất bản lần thứ 4, Tài liệu dịch của Viện Khoa học kỹ thuật Việt Nam, 59 trang. 13. Nguyễn Thị Hồng Liên (2010), Đánh giá khả năng chịu mặn và tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu mặn từ các giống lúa OM4498, VND95 - 20, IR64, CR203 bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên. 14. Lê Doãn Liên và cs (2001), “ Nghiên cứu chất lượng lúa Việt Nam”, Hội thảo quốc tế Sinh học Hà Nội, tr. 61- 68. 15. Nguyễn Hoàng Lộc (1992), Chọn dòng chịu muối NaCl và chịu mất nước ở thuốc lá (Nicotiana tabacum L.), Luận án phó Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội. 16. Tăng Thị Ngọc Mai (2011), Đánh giá khả năng chịu lạnh và tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh từ một số giống lúa bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro, Luận văn thạc sĩ sinh học, trường Đại Học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên. 17. Chu Văn Mẫn (2001), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB Đại học Khoa học tự nhiên, Hà Nội. 18. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong chọn giống cây trồng, Nxb Đại học Sư phạm Thái Nguyên. 19. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội, tr.34- 39. 20. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 21. Đinh Thị Phòng, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995), Sử dụng công nghệ tế bào thực vật để chọn dòng chịu mất nước ở lúa”, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 27-38. 45
11. 22. Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn tú, Phạm Xuân Hội (2009), “Nghiên cứu phân lập và chuyển gene MtOsDREB2A điều khiển tính chịu hạn vào giống lúa Chành trụi thông qua Agrobacterium”, Tạp chí Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 31(2),tr. 79-88. 23. Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 24. Nguyễn Thị Tâm, Tăng Thị Ngọc Mai, Chu Hoàng Mậu(2011), ‘‘Đánh giá khả năng chịu lạnh của các giống lúa Xuân Châu Hương, Q5, C27, Khang Dân, U17 và Nhị Ưu 63 bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thái Nguyên, số 6, tập 82, tr. 103 - 108. 25. Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Thu Giang (2008), ‘‘Đánh giá sự đa hình ADN của một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo mất nước’’, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thái Nguyên, số 4, tập 1, tr. 58 - 64. 26. Nguyễn Thị Tâm, Phạm Thị Thu Thuỳ, Nguyễn Thị Thu Hoài, Chu Hoàng Mậu (2005), “Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá khả năng chịu hạn một số giống lúa cạn địa phương”. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc - Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 1370-1372. 27. Nguyễn Đức Thành (2000), “Nuôi cấy mô tế bào thực vật – nghiên cứu và ứng dụng”, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 28. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), “ Xử lý kết quả nghiên cứu thực nghiệm trong nông lâm ngư nghiệp trên máy vi tính”, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 29. Nguyễn Tường Vân, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1994), Chọn dòng chịu muối ở lúa bằng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật, Kỉ yếu Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội, tr. 19 - 27. 30. Đỗ Năng Vịnh (2005), “Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng”, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 46
12. 31. Viện Nông hóa thổ nhưỡng (1998), Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón, cây trồng, Nxb Nông nghiệp. 32. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (1999), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh 33. Adkins S. W., Shiraishi T., Kunanuvatchaidach R., Godwin I. D. (1995), Somaclonal variation in rice drought - tolerance and other agrnomic characters, Aust J Bot 4, pp. 201 - 209. 34. Alia, Hayashi H., Sakamoto A., Murata N. (1998), “Enhancement of the tolerance of Arabidopsis to high temperatures by genetic engineering of the synthesis of glycinebetaine”, Plant J 16 (2), pp. 155 - 161. 35. Agarwal P, Agarwal PK, Nair S, Sopory SK, Reddy MK (2007), “Stress- inducible DREB2A transcription factor from Pennisetum glaucum is a phosphoprotein and its phosphorylation negatively regulates its DNA-binding activity”, Mol Genet Genomics, 277(2), pp 189-98. 36. Benze Xiao (2007), “Over - expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field condition”, Theor Appl Genet, 115, pp. 35 - 46. 37. Bouharmont J, Dekeyser A. (1989), “In vitro selection for cold and salt tolerance in rice”, Review of Advance in Plant Biotechnology, 1985 - 88. IMWIC & IRRI, pp. 308 - 313. 38. Bertin P., Kinet J. M., Bouharmont J. (1995), “Heritable chilling tolerance improvement in rice through somaclonal variation and cell line selection”, Aust J Bot, 44, pp. 91-105. 39. Dang Minh Tam, Nguyen Thi Lang (2003), In vitro selecsion for salt tolerance in rice, Omonrice, pp. 68-73. 40. Dubouzet JG, SakumaY, Kasuga M (2003) “ osDREB genes in rice, Oryza sativa L.encode transcription activator that funcion in drought, high- salt- anh cold- responsive gene exprenssion”, PlantJ, Feb, 33(4) pp. 63- 751. 47
13. 41. Foolad M.R., Siva A., and Rodriguez L. R. (1995), Application of polymerase chain reaction (PCR) to plant genome analysis, In: Tissue and organ culture, Fundamental method, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, pp. 281- 298. 42. Honghong Hu., Xiong Lizhong (2004), “Transcription factor gene OsNACx from rice and use thereof for improving plant tolerance to drought and salt”, Patent Application Publication. 43. Liu, Nanming Zhao, K. Yamaguch-Shinozaki and K. Shinozaki (2000), “Regulatory role of DREB transcription factors in plant drought, salt and cold tolerance”, Chinese Science Bulletin, 45, pp 970-975 44. Lifeng Zhao,Yibing Hu, Kang Chong, and Tai Wang (2010), “ ARAG1, an ABA-responsive DREB gene, plays a role in seed germination and drought tolerance of rice”, Journal List, v.105(3), pp 401- 409. 45. Mundy J., Chua H. N. (1998), “Abcisis acid and water stress induce the expression of a novel rice gene”, EMBOJ, 8, pp. 2279 - 2286. 46. Nakamura T., Yokota S., Muramoto Y., (1997), “Expression of a betaine aldehyde dehydrogenase gene in rice, a glycine betaine nonaccumulator and possible localization of its protein in peroxisomes”, Plant J 11, pp. 1115 - 1120. 47. Pradeep K. Agarwal, Parinita Agarwal, M. K. Reddy and Sudhir K. Sopory (2006), ”Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants”, Plant Cell Reports, 25, pp 1263-1274. 48. Qiuyun Wang, Yucheng Guan, Yaorong Wu, Honglin Chen, Fan Chen, Chengcai Chu (2008), “Overexpression of a rice OsDREB1F gene increases salt, drought, and low temperature tolerance in both Arabidopsis and rice”, Plant Mol Biol, 67, pp. 589 - 602. 49. Renata Pereira da Cruz, Sandra Cristina Kothe Milach (2004),” Cold tolerance at the germination stage of rice: methods of evaluation and characterization of genotypes”, Sci. Agric. (Piracicaba, Braz.), v.61, n.1, pp. 1- 8. 48
14. 50. Shinozaki et al,(2003) “OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in Drought-, high-salt-and cold- responsive gene expressio”, The Plant Journal, v.33, Issue 4, pp 751-763 51. S Mizuno, Y Hirasawa, M Sonoda, H Nakagawa (2006),” Isolation and characterization of three DREB/ERF-type transcription factors from melon”, Plant Science, 170, pp 1156–1163. 52. Yang SM, Zeng YW, Du J, Pu XY, Yang T, Tai LM, Cui H, Zhu GB, Yi JH (2007) “Analysis of cold tolerance at the seedling stage of backcross hybrids of Indica with core revenue for rice in Yunnan Landrace”, Ecology and Environment Bot 16, pp.1754-1758. 53. Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet JG, Abe H, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2002), “DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration- and cold-inducible gene expression”, Biochem Biophys Res Commun, 290(3), pp 998-1009. Trang web 54. 55. 56. 57. 58. 517376.html 59. 60. 109435.html 49